PCR實驗室在操作時應注意事項

  PCR檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導致各種問題，因此，進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染出現(xiàn)。

　　(1)劃分操作區(qū)：

　　目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：

　　①標本處理區(qū)，包括：擴增摸板制備;

　　②PCR擴增區(qū)，包括：反應液的配制和PCR擴增;

　　③產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。

　　※各工作區(qū)要具有一定隔離，操作器材專用，要有一定方向性，如，標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

　　切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

　　(2)分裝試劑：

　　PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝，所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源DNA：

　　①PCR用水應為高壓的雙蒸水;

　　②引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制;

　　③引物和d-NTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因;

　　(3)實驗操作注意事項：

　　盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。

　　因此：不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：

　　①戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套;

　　②使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染;

　　③避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

　　④操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度;

　　⑤最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管;

　　⑥操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性;

　　⑦盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如，沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);

　　⑧重復實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。

　　PCR擴增重要標準

　　什么是PCR實驗靈敏度?

　　靈敏度指的是PCR擴增反應能夠檢測到目的基因最小值。研究結(jié)果表明，影響PCR擴增效率的因素，如，模板的復雜程度與完整性、引物純度及其與模板結(jié)合效率、反應溫度、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成(主要指：陽離子)、反應優(yōu)化劑等，均決定PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規(guī)PCR反應能夠檢測到pg(10～12g)數(shù)量級目的基因。對于一個特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系(包括：DNA聚合酶與反應緩沖液等)就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關(guān)鍵因素了。

　　與實驗室自配PCR擴增體系相比，東盛Taq Mix對反應緩沖液中的成分進行優(yōu)化，并加入了適當比例的反應增強劑(PCR Enhancer)，提高DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級結(jié)構(gòu)對PCR擴增性能影響，使得DNA聚合酶處于最適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高檢測靈敏度。即時反應體系中只有幾個目的基因拷貝，也能輕松檢測。

　　什么是PCR實驗特異性?

　　特異性指的是在PCR擴增過程中，專一性擴增目的片段而非其他片段的性能。在PCR實驗本身的靈敏度很高，且實驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會在目的片段出現(xiàn)同時伴隨有其他雜帶，即，發(fā)生非特異性擴增現(xiàn)象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應條件控制等均會影響PCR擴增特異性。近年，研究結(jié)果表明，緩沖液品質(zhì)(如，離子種類與組成，反應優(yōu)化劑等)對保證PCR特異性擴增起著不可忽視的作用。一般緩沖液中調(diào)節(jié)氫鍵作用鹽只有KCl，而東盛HSTMTaq Mix的緩沖體系通過反應優(yōu)化劑以及KCl/(NH4)SO4鹽離子體系平衡調(diào)節(jié)，顯著提高PCR擴增特異性，降低背景。

　　PCR實驗靈敏度與特異性是一對此長彼消特性，這也決定我們實驗體系調(diào)節(jié)實際上就是需要找到適合實驗靈敏度與特異性平衡點。由于PCR體系中的眾多成分，使得組合較多，篩選工作繁雜。東盛基于靈敏度與特異性分別設(shè)計了PCR Mix和HS Taq Mix，幫您確定大平衡點，如果您需要更細致的平衡點，請選擇相應的Mix Kit系列進行微調(diào)。